Посветить лазером в нейрон: зачем генетики встраивают в рыбок гены змей

— Это только чистый эксперимент или оптогенетика может иметь практическое применение в медицине?

— Молекулярные инструменты оптогенетики имеют большой терапевтический потенциал, например, уже сейчас идут клинические испытания по терапии пигментозного ретинита с помощью опсинов.

— Но, как обычно, здесь есть «но». Давайте сразу перейдем к нему.

— Ну, а куда без «но». У оптогенетики есть несколько недостатков: во-первых, видимый свет, которым активируются каналородопсины, плохо проходит через биологические ткани. Это делает невозможным стимуляцию нейронов в глубине ткани.

Во-вторых, проводимость каналородопсинов низка, поэтому для того, чтобы активировать нейронный контур, необходимо использовать свет высокой мощности (обычно это синий лазер). Это способно вызывать фотоповреждение нейронов.

В-третьих, если для активации нейронов мыши используются оптические волокна, имплантированные прямо в ткань мозга, то другие классические объекты нейробиологии, мальки Danio rerio и плодовая мушка Drosophila melanogaster, освещаются снаружи, и они способны видеть свет, которым их активируют. То есть помимо специфического ответа, мы получаем еще возбуждение зрительных зон мозга – и порой сложно отделить один сигнал от другого в эксперименте.

— И как эти проблемы решали ваши предшественники?

— Были попытки частично решить эти проблемы при помощи хемогенетики. Есть ионные каналы, активируемые определенными химическими веществами. У них хорошая проводимость, но после введения активирующего вещества активируемые нейроны остаются «включенными», пока вещество не выведется из организма.

Другой подход, термогенетика, заключался в использовании ионных каналов, реагирующих на нагревание. Он использовался в экспериментах на дрозофилах: для активации нейронов воздух в контейнере с мухами подогревался, нагревая все животное. При этом нагрев и остывание происходит медленно, и, как и в случае с хемогенетикой, невозможно активировать отдельные нейроны, экспрессирующие нужный ионный канал, а только все сразу. Поэтому оптогенетика несомненно превосходила эти альтернативные подходы в высоком временном (миллисекундная шкала активации) и пространственном разрешении (десятки микрометров).

— Получается, вы сделали метод, который объединил разрешение оптогенетики и термогенетический принцип?

— Именно! В нашей работе мы разработали молекулярный и физический инструментарий для того, чтобы вывести термогенетику на уровень пространственно-временного разрешения, не уступающего оптогенетике. В качестве ионных каналов, рецепторов, мы взяли термочувствительные каналы семейства TRPA1 из змей.

У многих видов змей, например гремучих змей и щитомордников, есть так называемое термозрение, фактически, прибор ночного видения. У них на носу специальный орган — ямка, насыщенная окончаниями нейронов, несущих в своей мембране рецепторы TRPA1. Эта ямка является, по сути, тепловизором, позволяющим змее охотиться и ориентироваться в темноте.

Рецепторы TRPA1 исключительно чувствительны к тепловому инфракрасному излучению, позволяя змее чувствовать теплокровную добычу на расстоянии нескольких метров. Встраивая змеиные термоканалы в нейроны мыши или рыбки данио рерио, мы наделяли клетки чувствительностью к нагреванию.

— Но вы же не греете целиком аквариум с рерио?

— Нет, конечно [смеется]. Для этого Александр Прохоров с Николаем Басовым (советские физики, основоположники квантовой электроники, — прим. Indicator.Ru) создали лазеры, в том числе и инфракрасные. В качестве источника нагрева мы использовали инфракрасные лазеры, излучающие в диапазоне от 1 до 1,5 мкм. Инфракрасное излучение гораздо глубже, по сравнению с используемым в оптогенетике видимым светом, проникает в ткань, и оно не фототоксично.

Кроме того, варьируя длину волны, можно менять степень поглощения ИК-излучения тканью, и тем самым варьировать глубину и интенсивность нагрева. Импульсное лазерное излучение позволяет активировать нейроны заданной частотой импульсов.

— Как я понимаю, в этой работе было много технических сложностей. Можно ли подробнее рассказать о деталях?

— Перед нами стояла задача нагревать нейроны импульсным ИК-лазером, но так, чтобы в ответ на каждый импульс мы получали локальный нагрев области размером в несколько десятков микрометров на температуру, не превышающую 1-2°C. Недостаточный нагрев не позволил бы активировать нейрон. Избыточный нагрев приведет к гибели нейронов. Как измерить температуру точно и локально? Как откалибровать оптическую установку так, чтобы мощность лазера соответствовала необходимым температурам нагрева?

Для решения этих задач мы использовали квантовый термометр — микроскопический алмаз, в кристаллической решетке которого присутствуют так называемые NV-дефекты. В некоторых положениях решетки вместо углерода находится атом азота (N), а соседняя позиция пустует, т.е. валентна (V). Такой микроалмаз помещается на кончик оптического волокна, через которое он освещается видимым светом. Кроме того, к алмазу подводится локальный генератор СВЧ.

Взаимодействие ИК-излучения алмаза с СВЧ-излучением зависит от температуры, и это взаимодействие можно видеть по параметрам ИК-спектра. Помещая этот зонд в непосредственной близости от клетки, можно измерить, какая мощность ИК-лазера необходима для локального нагрева на заданную температуру. Работы по ИК-фотонике и квантовой термометрии велись совместно с лабораторией Алексея Желтикова в Московском государственном университете.

Наконец, оценить, что именно происходит с мембраной нейрона при нагреве, с какой скоростью происходит деполяризация мембраны, как генерируется потенциал действия, можно исключительно методами классической нейрофизиологии, помещая в клетку электрод и прописывая токи через мембрану при активации TRPA1. Эти эксперименты позволили установить, что с помощью импульсного излучения мы можем генерировать потенциалы действия с частотой до 50 Гц. Это свидетельствует о том, что рецепторы, которые мы используем, не уступают по своим временным характеристикам каналородопсинам, используемым в оптогенетике. Эта часть работы была выполнена в сотрудничестве с группой Евгения Никитина из Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

— А какие эксперименты вы ставили с реальными организмами?

— Значительная часть экспериментов по характеризации каналов TRPA1 змей в клетках млекопитающих и по квантовой термометрии была выполнена на культуре нейронов мыши. Но хороший метод должен работать и на уровне живого организма.

В мальке рыбы данио есть так называемые соматосенсорные нейроны, ответственные за чувствительность к прикосновениям. Их активация приводит к реакции избегания: рыба пытается уплыть, делая быстрый взмах хвостом. Мы получили мальков, которые несут в соматосенсорных нейронах ген TRPA1 гремучей змеи. В таких мальках получалось активировать реакцию избегания, не прибегая к механическому воздействию, но активируя нейроны инфракрасным лазером с диаметром светового пучка 60 мкм. Контрольные рыбы, не несущие ген TRPA1, были нечувствительны к воздействию ИК-излучения.

— Можно пару слов про финансирование работы?

— В данном проекте исключительно важен именно его междисциплинарный характер. Исследование не носило бы завершенный характер, если бы в нем не приняли участие коллективы с разной, взаимодополняющей экспертизой. Необходимо также особо отметить роль Российского научного фонда, поддержка которого по гранту 14-14-0747 составила основу финансирования проекта, а также Российского фонда фундаментальных исследований, поддержавшего работы по квантовой термометрии.

— Какие дальнейшие планы и перспективы у этой темы?

— Ведутся работы по смене ионной селективности TRPA1, чтобы каналы лучше пропускали одновалентные катионы натрия и калия и хуже — двухвалентный кальций. Это повысит избирательность стимуляции. Если же удастся заставить канал проводить анионы хлора, то с помощью этих каналов можно будет подавлять активность нейронов.

В настоящее время мы также работаем над термогенетической активацией сердечной мышцы, встраивая змеиные TRPA1 в кардиомиоциты. Кроме того, данные каналы позволят управлять динамикой ионов кальция в самых разных типах клеток. Все это, во-первых, создаст обширную методическую базу для применения термогенетики в нейробиологии и других фундаментальных областях науки, а во-вторых, создаст задел для новых терапевтических подходов. Инструменты оптогенетики уже используются в ряде клинических испытаний для восстановления функций утраченных нейронов. Преимущество термогенетики в том, что она применима не только для управления нейронами, но и для стимуляции кальций-зависимых процессов в других типах клеток.

Источник: http://rscf.ru/ru/node/2325