Чтобы понять, как устроена система защиты грибов от вредных для них лекарственных препаратов, российские ученые использовали специально созданные светящиеся белки. Однако обойти оборону дрожжей так и не удалось. Исследование показало, что устойчивость дрожжей (и, возможно, патогенных грибов) к антимикотикам устроена сложнее, чем считалось прежде. Работа проходила в рамках проекта «Ноев ковчег» при поддержке Российского научного фонда (РНФ), ее результаты опубликованы в журнале Scientific Reports.
Устойчивость патогенных микроорганизмов к лекарствам — серьезная медицинская проблема. Наиболее известны «супербактерии», устойчивые к антибиотикам, но некоторые патогенные грибы в ходе эволюции тоже приобрели механизмы защиты от антигрибковых препаратов — антимикотиков. Один из таких механизмов — сверхактивация АВС-переносчиков. Такие белки-переносчики находятся в мембране клетки гриба и выбрасывают потенциально опасные вещества из цитоплазмы.
У грибов с устойчивостью ко многим лекарствам АВС-переносчики «выбрасывают» из клетки разные виды антимикотиков, и эффективность лечения от грибковых инфекций существенно снижается. В предыдущем исследовании ученые из МГУ имени Ломоносова подавляли устойчивость грибов к лекарствам. Для этого они «обманывали» защитный механизм обыкновенных пекарских дрожжей при помощи относительно безвредных для микроорганизмов липофильных катионов (умеренно растворимых в воде положительно заряженных ионов). Эти катионы легко проникают через клеточные мембраны и светятся при облучении, поэтому часто используются в подобных исследованиях.
Ученые воспользовались свойством этих веществ возвращаться в клетку после того, как их «выбрасывают» оттуда АВС-переносчики. Таким образом занятые бессмысленной работой по перекачке туда-сюда липофильных катионов АВС-переносчики не трогали антигрибковый препарат, и он накапливался в цитоплазме. Новое исследование стало логическим продолжением предыдущих результатов.
«Когда в клетке повышается концентрация чужеродных веществ, она запускает компенсаторный ответ — начинает производить больше АВС-переносчиков, чтобы быстрее выкачивать потенциально опасные соединения, — поясняет один из авторов работы, старший научный сотрудник НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ Дмитрий Кнорре. — Мы предполагали, что липофильные катионы не вызовут компенсаторного ответа. Дело в том, что благодаря своему положительному заряду они проникают в отрицательно заряженные органеллы клетки — митохондрии — и накапливаются там. То есть в цитоплазме клетки, обработанной липофильными катионами, не будет значительной концентрации этих веществ. А сенсорные системы грибов, как нам было известно, улавливают чужеродные соединения в цитоплазме. Наш расчет состоял в том, что в митохондриях клетка не обнаружит посторонние вещества, и сверхактивации АВС-переносчиков не произойдет».
Чтобы проверить эту гипотезу, исследователи добавили к культуре пекарских дрожжей один из липофильных катионов — додецилтрифенилфосфоний (С12ТРР). Для удобства исследования ученые создали химерный белок: одна его часть оставалась такой же, как основной АВС-переносчик у грибов, а вторая представляла собой зеленый флуоресцентный белок. Под облучением такое соединение интенсивно светится, и за его накоплением в клетках можно наблюдать в флуоресцентный микроскоп. Остальные свойства химерного белка не изменились, и в клетке он выполнял функцию АВС-переносчика.
Результаты исследования показали, что взаимодействие с липофильными катионами все же заставляет клетки дрожжей запускать компенсаторный ответ. В присутствии липофильных катионов дрожжи производили и накапливали заметно больше АВС-переносчиков, чем в обычных условиях. Другие методы также показали, что устойчивость к лекарствам под действием липофильных катионов увеличивается. Пока неизвестен механизм, который позволяет клетке обнаружить чужеродные соединения в митохондриях. Вероятно, одновременно в ней работает несколько взаимодополняющих систем, которые реагируют на потенциально опасные вещества. Реальные принципы их работы еще предстоит изучить. Авторы планируют проводить будущие исследования как на культуре пекарских дрожжей, так и на патогенных видах грибов.
В работе над исследованием участвовали научные сотрудники факультета биоинженерии и биоинформатики, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, НИИ митоинженерии МГУ имени М.В. Ломоносова и Института молекулярной медицины ПМГМУ имени И. М. Сеченова.
