Российские ученые исследовали, каким образом влияет на активность и физико-химические свойства рекомбинантных белков добавление к их первичной структуре «хвостов» из нескольких остатков аминокислоты гистидина. Результаты опубликованы в журнале International Journal of Biological Macromolecules.
Добавление полигистидинового «хвоста» к концу рекомбинантного белка представляет собой одну из наиболее распространенных генетических модификаций рекомбинантных белков и широко используется исследователями. Наличие этой модификации позволяет существенно упростить выделение и очистку целевого белка, зачастую сводя его к одностадийной хроматографии на сорбенте, содержащей ионы никеля, кобальта или меди. Целевой белок, обладающий таким «хвостом», удерживается на металлосодержащем сорбенте, в отличие от всех остальных клеточных белков, не имеющих такого «хвоста». Затем связавшийся белок смывают с сорбента с помощью буфера, содержащего имидазол. Но у исследователей, работающих с подобными белками, возникает вопрос: не влияет ли такая модификация на структуру и функцию конкретного белка. К настоящему времени подобных исследований проводилось крайне мало.
Ученые из Лаборатории ЯМР-исследований биосистем Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН проанализировали влияние добавления полигистидинового «хвоста» на ферментативную активность и структуру хорошо изученного белка эндолизина бактериофага Т5. Применение этого белка для биотехнологии и медицины представляется очень перспективным: исследователи уже продемонстрировали его способность в присутствии антисептиков активно уничтожать болезнетворные бактерии, и в будущем, вполне вероятно, эндолизин бактериофага Т5 может стать средством, альтернативным антибиотикам. Поэтому оптимизация условий очистки такого белка и последствия такой оптимизации, несомненно, представляют большой интерес.
Помимо сугубо практического интереса именно этот белок привлек внимание ученых в качестве модели еще по нескольким причинам. «Во-первых, эндолизин является ферментом, и ферментативную активность и функциональные свойства рекомбинантного белка с гистидиновым «хвостом» можно измерить и сравнить с достаточной степенью достоверности со свойствами белка без «хвоста». Во-вторых, это небольшой белок (его длина 137 аминокислотных остатков), структура которого в растворе может быть проанализирована с помощью ЯМР (ядерного магнитного резонанса) высокого разрешения», — рассказал заведующий Лабораторией ЯМР-исследований биосистем ИТЭБ РАН, доктор физико-математических наук Виктор Кутышенко.
Кроме того, интересным моментом в этом исследовании был тот факт, что активный центр эндолизина бактериофага Т5 расположен вблизи С-конца полипептидной цепи этого белка, где ученые расположили и полигистидиновый «хвост». Не повлияет ли подобное близкое соседство «хвоста» и активного центра на сворачивание полипептидной цепи?
Оказалось, что сам по себе гистидиновый «хвост» не оказывает значительного влияния ни на активность, ни на фолдинг белка. Не меняется и связывание ионов цинка и кальция с белком. Тем не менее ученые выяснили, что эндолизин с гистидиновым «хвостом» хранится без потери ферментативной активности меньше, чем фермент без «хвоста». Как предполагают исследователи, это связано с тем, что рекомбинантный белок, несущий полигистидиновый «хвост», склонен к самоассоциации. Также оказалось, что изменилась термостабильность белка: она снизилась на 100 °C. Помимо всего вышесказанного, негативное влияние на активность фермента оказывает присутствие имидазола и ионов никеля, которые появляются в белковом растворе во время хроматографической очистки. Активность белка может быть восстановлена путем тщательного вымывания этих низкомолекулярных примесей с помощью длительного диализа целевого белка в специально подобранных условиях.
Авторы работы отмечают, что данные, полученные для конкретного белка — эндолизина бактериофага Т5, нельзя догматически проецировать на другие белки. Тем не менее их выводы помогут исследователям, планирующим работу с рекомбинантными белками, выбрать правильную стратегию для выполнения своих задач.
